导读
随着分子生物学技术的不断更新和发展，分子诊断的方法成为技术。特别是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的分子诊断法，因具有快速、灵敏、特异等显著特点，已成为病原体核酸检测的新标准。
核酸检测技术的开展大大提高了疾病的诊断效率和准确率，同时为临床治疗的监测提供了快速、准确的方法，很大程度上弥补了传统检测方法的不足。目前，核酸检测已在国内外医院、检测机构、实验室等多种平台普遍开展使用。核酸检测包括定性检测和定量检测，定性检测多适用于疾病的诊断过程，而定量检测则普遍适用于疾病诊断和治疗监测的各个环节。核酸定量检测可以通过多种技术手段来完成，其中最为常用的是实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，q-PCR)检测技术，该技术也是医学界公认的扩增效率高、灵敏度高、稳定性好、重复性好的先进的艾滋病检测方法。
实时荧光定量PCR检测技术的原理
q-PCR检测技术是一种实时监控核酸扩增的技术，通过在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。
图1 PCR过程中荧光信号的积累
1.数学原理
PCR曲线有两种表现形式：线性图谱和对数图谱。
图2 扩增图谱与扩增阶段
PCR扩增经历四个阶段，依次为基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。扩增产物遵循理论方程：Y=X(1+E)n（Y=扩增产物，X=起始浓度，E=扩增效率，n=循环数）。
PCR扩增结束后，根据Ct值和初始浓度的线性方程式Ct=-klgX0+b，计算被测样本中核酸的初始浓度。
图3 起始浓度与Ct值的关系图
注：Ct值代表样本扩增曲线中，从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。
2. 化学原理
在q-PCR扩增中，最常用的荧光标记方法有两种：荧光染料法和TaqMan探针法。
荧光染料：最常用的荧光染料是SYBRGreen I。SYBRGreen I是一种DNA小沟结合染料，与双链DNA（dsDNA）特异性结合后，荧光信号会大幅度增强。
图4 PCR扩增与荧光信号的收集（染料法）
绘制出荧光信号增强的曲线图，与标准核酸荧光信号的曲线比较分析进行定量。其缺点在于该染料可能与非特异性的双链DNA（如反应的引物二聚体）结合，对实验结果产生干扰。因此，在体外诊断领域应用较少。
TaqMan探针：是一种水解型探针。通过TaqMan酶在特异性引物上增加一条荧光双标记的探针，分别标记有荧光信号基团R（Reporter）和淬灭基团Q（Quncher），当探针上的R基团和Q基团都存在时不发出荧光信号。在PCR的反应过程中，TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针的碱基水解，R基团和Q基团分离，R基团随即发出荧光信号。
图5 PCR扩增与荧光信号的收集（探针法）
随着模板扩增，特异性的DNA数量呈几何级增加，积累荧光的信号也越来越强。通过对荧光信号的检测以及荧光信号曲线的绘制，完成被测样本中核酸的定量检测。
应用
q-PCR的应用范围很广泛，可用于生命科学的各个领域，例如定量分析各种基因的表达分析，基因突变和多态性分析；在生物医疗领域，可用于遗传病诊断、肿瘤用药指导、病原体检测、耐药性分析等，显示出了广阔的应用前景。
